Hidrológiai Közlöny 2001 (81. évfolyam)

5-6. szám - XLII. Hidrobiológus Napok: „A magyar hidrobiológia időszerű kérdései az ezredfordulón” Tihany, 2000. október 4–6.

405 A NADP-fü­ggő izocitrát-dehidrogenáz (NADP-IDH) enzim aktivitá­sának változása a mikrocisztinnel kezelt nád (Phragmites australis /Cav./ Trin. Ex Steud.) sejtszuszpenziós tenyészetekben Máthé Csaba, Bakos Ferenc, M­ikóné Hamvas Márta, Surányi Gyula, Vasas Gábor, Molnár Erika, Grigorszky István és Borbély György Debreceni Egyetem, Természettudományi Kar, Növénytani Tanszék, 2010. Debrecen, Egyetem tér 1, PF 14. Kivonat: A citoszolikus NADP-fü­ggő izocitrát-dehidrogenáz (NADP-IDH) a növények aminosav anyagcseréjében fontos szerepet játszik. A növényi rendszerekben a NADP-IDH aktivitás szabályozásáról kevés adat ismeretes. Elfogadott, hogy a magasabbrendű növényekben stressz hatására (pl. ettolált növényekben az energiaéhezés) az enzim aktivitása csökken. Ko­rábban megállapítottuk, hogy a nád szövettenyészetek (kalluszok, kalluszból regenerált "mini" növények, sejtszuszpenziós tenyészetek) növekedését az 1 és 2A típusú protein foszfatázokat specifikusan gátló cianotoxin, a mikrocisztin-LR gátolja. A Murashige-Skoog táptalajon nevelt sejteket nátrium-acetáttal, illetve tisztított mikrocisztin-LR-rel kezelve a NADP-IDH aktivitás csökkenését tapasztaltuk. Ha a sejtszuszpenziós tenyészetet 3 napon át acetáton neveljük, majd megvonjuk az acetátot, az enzim aktivitása visszaáll a kontrollra jellemző szintre, de ezt a folyamatot a mikrocisztin-LR gátolja. Ha az en­zimaktivitást limitált szubsztrát koncentráció mellett mérjük, a cianotoxin kezelt szuszpenziók NADP-IDH aktivitás csök­kenése nagyobb mértékű, mint a telítési szubsztrát koncentráció jelenlétében mért enzimaktivitás csökkenés Kulcsszavak: mikrocisztin-LR, Phragmites australis, NADP-függő izocitromsav-dehidrogenáz (NADP-IDH) Bevezetés A cianotoxinok közül a Microcystis aeruginosa által termelt mikro­cisztinek a legismertebbek. A mikrocisztinek a hepatotoxinok családjába tartoznak és specifikus módon gátolják az 1 és a 2A típusú, szerin­treonin protein-foszfatázokat (Carmichael, 1994). A mikrocisztin-LR a növények növekedését, fejlődését gátolja, a sejtciklus és a fotoszintézis protein foszfontáció függő folyamatait befolyásolhatja. Előzetes kísérleteinkben, az ökológiai fontosságára való tekintettel, nád (Phragmites australis) kalluszokat és sejtszuszpenziós tenyészeteket állítottunk elő (Máthé és mtsai, 1999) Jelen munkánkban nád embrio­gén sejtszuszpenziót használtuk, mivel jól kontrollálható, stabil rendszer­nek bizonyult. A mikrocisztin-LR hatására a növényekben lejátszódó, a növekedést gátló stresszfolyamatok alig ismertek. Munkánkban a fenti cianotoxin a növényi (nád) NADP függő izocitrát-dehidrogenáz (NADP-IDH) enzim­re kifejtett hatását tanulmányoztuk. A NADP-IDH az izocitromsav átala­kulását katalizálja a-oxoglutáriavá (a-OG), miközben NADP redukció következik be. A citoszolikus NADP-IDH a növényi sejt teljes NADP­IDH aktivitásának 90 %-át adja. Fontos szerepet játszik az aminosav a­nyagcserében (Gátvez és Gadal, 1995). Felvetődik a gondolat, hogy a nád sejtszuszpenziókban a cianotoxin kezelés az enzim aktivitását befo­lyásolhatja. Anyag és módszer A mikrocisztin-LR izolálásához használt Microcystis aerugi­nosa a Velencei-tó 1991-es vízvirágzásából származó, BGSD 243 jelű törzs volt. A Microcystis aeruginosa toxinjainak izolá­lását Kós és mtsai (1995) módosított eljárása szerint végeztük. Az eljárás során a nyers cianotoxin kivonatot 5 %-os ecetsav he­lyett 45 mM-os perklórsavval készítettük. A nád sejtszuszpenzi­ós tenyészeteket felületi sterilizált nóduszokból állították elő, módosított MS (Murashige-Skoog, 1962) táptalajon. A sejt­szuszpenziókat mikrofiter lemezeken, 500 fil táptalajban nevel­tük és a növekedésüket a Bradford módszerrel meghatározott fe­hérjetartalom alapján követtük nyomon (Bradford, 1976). A to­xinkezeléseket tisztított mikrocisztin-LR-rel végeztük, 0,5 % (minimál táptalaj), ill. 2 % (teljes táptalaj) szacharóz tartalmú táptalajon. A NADP-IDH aktivitás meghatározása az időegység alatt ke­letkezett NADPH mennyiségének mérésén alapszik (n" NAD­PH perc"1 mg fehérje "). A citoszolikus NADP-IDH aktivitás meghatározásához a nád sejtszuszpenziót 1000-es percenkénti fordulatszámon (1000 RPM) 5 percig centrifugáltuk, majd a fe­lülúszót eltávolítottuk, a kiülepedett sejteket kivonó pufferrel mostuk. A kétszer átmosott sejtekből enzimkivonatot készítet­tünk. A kivonó puffer összetétele 50 mM Trisz-HCl (pH 7,6), 5 % glicerin, 100 mM ß-merkapto-etanol (BME), 1 mM fenil-me­til-szulfonil-fluorid (PMSF), 2 mM EDTA és 20 % etilén-glikol (EG) volt. Az enzimaktivitást 1 mM NADP-t, D,L-izocitrátot (10 mM biztosította a VnlM, 3,33 mM a VbTM körülményeket), 50 mM Trisz-HCl puffert (pH 8,0), 3 mM MgCl2-ot tartalmazó re­akcióelegyben határozták meg 0,5 ml végtérfogatban (Mcintosh és Oliver, 1992). Az eredmények és a megbeszélés A nád embriogén sejtszuszpenziós tenyészetek érzékeny rendszernek bizonyultak a cianotoxin tesztekben (Máthé és mts­ai, 1999). Jelen vizsgálatainkban a mikrocisztin-LR a nád sejt­szuszpenziók növekedését gátolta, amit a tenyészet fehérjetartal­mának csökkenése mutat. A minimál táptalajon a cianotoxin o­kozta gátlás nagyobb mértékű volt, mint a teljes táptalajon (1. ábra, A.). Hasonló jelenség volt megfigyelhető a citoszolikus NADP-IDH aktivitások vizsgálata során (1. ábra, B). A mini­mál táptalaj alacsony szénforrás tartalma érzékennyé tette a te­nyészeteket a cianotoxinnal szemben. Feltételezzük, hogy a NA­DP-IDH aktivitás csökkenése, az aminosav szintézisre gyakorolt közvetlen befolyása miatt a sejtszuszpenzió növekedését gátolja. A minimál táptalajon, acetáton nevelt E. coli tenyészetekben a NADP-IDH aktivitás csökken, az acetát az enzim poszttransz­lációs módosulásait idézi elő. Az acetát az élesztő tenyészetek­ben is befolyásolja a NADP-IDH aktivitást (Gálvez, Gadal, 1995). A nád növényekben a természetes körülmények között, az üledékben mikrobiális úton keletkező szerves savak (ecetsav, propionsav) növekedésgátlást és anatómiai rendellenességeket okoznak (Armstrong és mtsai, 1996). A kísérleteinkben a mini­mál táptalajon, acetáton nevelt nád sejtszuszpenziók növekedése lelassult és a NADP-IDH aktivitás csökkent (1 ábra). Ha a te­nyészetekből eltávolítottuk az acetátot, a növekedés sebessége és a NADP-IDH aktivitás visszaállt a kontrollra jellemző szint­re Az acetát gátlás alól felszabaduló NADP-IDH enzimaktivitás a mikrocisztin-LR jelenlétében gátolható volt (3. ábra). Való­színűsíthető, hogy a jelenség mechanizmusa összevethető a bakteriális és élesztő rendszerekével, ennek vizsgálatát a követ­kezőkben tervezzük. Ha a teljes táptalajon nevelt sejtszuszpenzió NADP-IDH ak­tivitását limitált szubsztrát koncentráció jelenlétében mértük (Vi­m), a mikrocisztin-LR hatására nagyobb mértékű enzimakti­vitás csökkenést észleltünk (4. ábra), mint VTM körülmények között. Az előzőhöz hasonló jelenséget a növényi szacharóz­foszfát szintetáz enzim esetében írtak le, ahol a V­TM körülmé­nyek között mért enzimaktivitás a fehérje poszttranszlációs mó­dosulásától függ (Pathre és mtsai, 2000). Az előbbiek alapján hasonló mechanizmus jelenléte feltételezhető, ami független bio­kémiai megközelítéssel is igazolandó a jövőben.

Next