Hidrológiai Közlöny 2001 (81. évfolyam)
5-6. szám - XLII. Hidrobiológus Napok: „A magyar hidrobiológia időszerű kérdései az ezredfordulón” Tihany, 2000. október 4–6.
405 A NADP-függő izocitrát-dehidrogenáz (NADP-IDH) enzim aktivitásának változása a mikrocisztinnel kezelt nád (Phragmites australis /Cav./ Trin. Ex Steud.) sejtszuszpenziós tenyészetekben Máthé Csaba, Bakos Ferenc, Mikóné Hamvas Márta, Surányi Gyula, Vasas Gábor, Molnár Erika, Grigorszky István és Borbély György Debreceni Egyetem, Természettudományi Kar, Növénytani Tanszék, 2010. Debrecen, Egyetem tér 1, PF 14. Kivonat: A citoszolikus NADP-függő izocitrát-dehidrogenáz (NADP-IDH) a növények aminosav anyagcseréjében fontos szerepet játszik. A növényi rendszerekben a NADP-IDH aktivitás szabályozásáról kevés adat ismeretes. Elfogadott, hogy a magasabbrendű növényekben stressz hatására (pl. ettolált növényekben az energiaéhezés) az enzim aktivitása csökken. Korábban megállapítottuk, hogy a nád szövettenyészetek (kalluszok, kalluszból regenerált "mini" növények, sejtszuszpenziós tenyészetek) növekedését az 1 és 2A típusú protein foszfatázokat specifikusan gátló cianotoxin, a mikrocisztin-LR gátolja. A Murashige-Skoog táptalajon nevelt sejteket nátrium-acetáttal, illetve tisztított mikrocisztin-LR-rel kezelve a NADP-IDH aktivitás csökkenését tapasztaltuk. Ha a sejtszuszpenziós tenyészetet 3 napon át acetáton neveljük, majd megvonjuk az acetátot, az enzim aktivitása visszaáll a kontrollra jellemző szintre, de ezt a folyamatot a mikrocisztin-LR gátolja. Ha az enzimaktivitást limitált szubsztrát koncentráció mellett mérjük, a cianotoxin kezelt szuszpenziók NADP-IDH aktivitás csökkenése nagyobb mértékű, mint a telítési szubsztrát koncentráció jelenlétében mért enzimaktivitás csökkenés Kulcsszavak: mikrocisztin-LR, Phragmites australis, NADP-függő izocitromsav-dehidrogenáz (NADP-IDH) Bevezetés A cianotoxinok közül a Microcystis aeruginosa által termelt mikrocisztinek a legismertebbek. A mikrocisztinek a hepatotoxinok családjába tartoznak és specifikus módon gátolják az 1 és a 2A típusú, szerintreonin protein-foszfatázokat (Carmichael, 1994). A mikrocisztin-LR a növények növekedését, fejlődését gátolja, a sejtciklus és a fotoszintézis protein foszfontáció függő folyamatait befolyásolhatja. Előzetes kísérleteinkben, az ökológiai fontosságára való tekintettel, nád (Phragmites australis) kalluszokat és sejtszuszpenziós tenyészeteket állítottunk elő (Máthé és mtsai, 1999) Jelen munkánkban nád embriogén sejtszuszpenziót használtuk, mivel jól kontrollálható, stabil rendszernek bizonyult. A mikrocisztin-LR hatására a növényekben lejátszódó, a növekedést gátló stresszfolyamatok alig ismertek. Munkánkban a fenti cianotoxin a növényi (nád) NADP függő izocitrát-dehidrogenáz (NADP-IDH) enzimre kifejtett hatását tanulmányoztuk. A NADP-IDH az izocitromsav átalakulását katalizálja a-oxoglutáriavá (a-OG), miközben NADP redukció következik be. A citoszolikus NADP-IDH a növényi sejt teljes NADPIDH aktivitásának 90 %-át adja. Fontos szerepet játszik az aminosav anyagcserében (Gátvez és Gadal, 1995). Felvetődik a gondolat, hogy a nád sejtszuszpenziókban a cianotoxin kezelés az enzim aktivitását befolyásolhatja. Anyag és módszer A mikrocisztin-LR izolálásához használt Microcystis aeruginosa a Velencei-tó 1991-es vízvirágzásából származó, BGSD 243 jelű törzs volt. A Microcystis aeruginosa toxinjainak izolálását Kós és mtsai (1995) módosított eljárása szerint végeztük. Az eljárás során a nyers cianotoxin kivonatot 5 %-os ecetsav helyett 45 mM-os perklórsavval készítettük. A nád sejtszuszpenziós tenyészeteket felületi sterilizált nóduszokból állították elő, módosított MS (Murashige-Skoog, 1962) táptalajon. A sejtszuszpenziókat mikrofiter lemezeken, 500 fil táptalajban neveltük és a növekedésüket a Bradford módszerrel meghatározott fehérjetartalom alapján követtük nyomon (Bradford, 1976). A toxinkezeléseket tisztított mikrocisztin-LR-rel végeztük, 0,5 % (minimál táptalaj), ill. 2 % (teljes táptalaj) szacharóz tartalmú táptalajon. A NADP-IDH aktivitás meghatározása az időegység alatt keletkezett NADPH mennyiségének mérésén alapszik (n" NADPH perc"1 mg fehérje "). A citoszolikus NADP-IDH aktivitás meghatározásához a nád sejtszuszpenziót 1000-es percenkénti fordulatszámon (1000 RPM) 5 percig centrifugáltuk, majd a felülúszót eltávolítottuk, a kiülepedett sejteket kivonó pufferrel mostuk. A kétszer átmosott sejtekből enzimkivonatot készítettünk. A kivonó puffer összetétele 50 mM Trisz-HCl (pH 7,6), 5 % glicerin, 100 mM ß-merkapto-etanol (BME), 1 mM fenil-metil-szulfonil-fluorid (PMSF), 2 mM EDTA és 20 % etilén-glikol (EG) volt. Az enzimaktivitást 1 mM NADP-t, D,L-izocitrátot (10 mM biztosította a VnlM, 3,33 mM a VbTM körülményeket), 50 mM Trisz-HCl puffert (pH 8,0), 3 mM MgCl2-ot tartalmazó reakcióelegyben határozták meg 0,5 ml végtérfogatban (Mcintosh és Oliver, 1992). Az eredmények és a megbeszélés A nád embriogén sejtszuszpenziós tenyészetek érzékeny rendszernek bizonyultak a cianotoxin tesztekben (Máthé és mtsai, 1999). Jelen vizsgálatainkban a mikrocisztin-LR a nád sejtszuszpenziók növekedését gátolta, amit a tenyészet fehérjetartalmának csökkenése mutat. A minimál táptalajon a cianotoxin okozta gátlás nagyobb mértékű volt, mint a teljes táptalajon (1. ábra, A.). Hasonló jelenség volt megfigyelhető a citoszolikus NADP-IDH aktivitások vizsgálata során (1. ábra, B). A minimál táptalaj alacsony szénforrás tartalma érzékennyé tette a tenyészeteket a cianotoxinnal szemben. Feltételezzük, hogy a NADP-IDH aktivitás csökkenése, az aminosav szintézisre gyakorolt közvetlen befolyása miatt a sejtszuszpenzió növekedését gátolja. A minimál táptalajon, acetáton nevelt E. coli tenyészetekben a NADP-IDH aktivitás csökken, az acetát az enzim poszttranszlációs módosulásait idézi elő. Az acetát az élesztő tenyészetekben is befolyásolja a NADP-IDH aktivitást (Gálvez, Gadal, 1995). A nád növényekben a természetes körülmények között, az üledékben mikrobiális úton keletkező szerves savak (ecetsav, propionsav) növekedésgátlást és anatómiai rendellenességeket okoznak (Armstrong és mtsai, 1996). A kísérleteinkben a minimál táptalajon, acetáton nevelt nád sejtszuszpenziók növekedése lelassult és a NADP-IDH aktivitás csökkent (1 ábra). Ha a tenyészetekből eltávolítottuk az acetátot, a növekedés sebessége és a NADP-IDH aktivitás visszaállt a kontrollra jellemző szintre Az acetát gátlás alól felszabaduló NADP-IDH enzimaktivitás a mikrocisztin-LR jelenlétében gátolható volt (3. ábra). Valószínűsíthető, hogy a jelenség mechanizmusa összevethető a bakteriális és élesztő rendszerekével, ennek vizsgálatát a következőkben tervezzük. Ha a teljes táptalajon nevelt sejtszuszpenzió NADP-IDH aktivitását limitált szubsztrát koncentráció jelenlétében mértük (Vim), a mikrocisztin-LR hatására nagyobb mértékű enzimaktivitás csökkenést észleltünk (4. ábra), mint VTM körülmények között. Az előzőhöz hasonló jelenséget a növényi szacharózfoszfát szintetáz enzim esetében írtak le, ahol a VTM körülmények között mért enzimaktivitás a fehérje poszttranszlációs módosulásától függ (Pathre és mtsai, 2000). Az előbbiek alapján hasonló mechanizmus jelenléte feltételezhető, ami független biokémiai megközelítéssel is igazolandó a jövőben.