Hidrológiai Közlöny 2004 (84. évfolyam)
5-6. szám - XLV. Hidrobilógus Napok „Vizeink hosszú idejű változásai” Tihany, 2003. október 1–3.
HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2004. 84. ÉVF. Bevezetés Napjainkban egyre több stressztényező hat környezetünkre. E tényezők összessége rövid és/vagy hosszú távú változásokat idéz elő az élőlények anyagcsere folyamataiban. Ilyen stressz-tényezőnek számít a toxikus vízvirágzások alkalmából a felszíni vizekbe kerülő nagy mennyiségű eianotoxin, például mikrocisztin (MYCLR), mely feltehetőleg közvetlenül hat a jelenlévő vízinövényekre (Vasas és mtsai 2002; Vasas és mtsai 2003). Irodalmi adatokból ismert, hogy a fenilalanin-ammónia hiáz, a fenil-propanoid metabolizmus kiindulási enzime meghatározó szerepet játszik a fenolos anyagok bioszintézisében a növények esetében (Lawton és mtsai, 1980). Az enzimreakció során keletkezett fenolos anyagok egy része védelmi szerepet lát el, segítve ezáltal a növényi kórokozók elleni küzdelmet, más részük beépül a szövetekbe (lignifikáció, Nagarathna és mtsai, 1993). Kutatócsoportunk eddigi munkája során több tesztnövény esetében tapasztalt szövetelhalást, valamint fenolos anyagok felhalmozódását MYCLR kezelés hatására (M-Hamvas és mtsai , 2003; Máthé és mtsai, 1998). Mindezidáig nem találtunk irodalmi utalást arra vonatkozólag, hogy nádnövényből előállított kalluszok, illetve ezen kalluszokból regenerált, úgynevezett "mini" nádnövények fenilalanin-ammónia liáz aktivitása hogyan változhat a stressz körülmények között. Munkánk során kidolgoztunk egy módszert a fenilalaninammónia liáz enzimaktivitás vizsgálatára, illetve meghatároztuk az enzimaktivitást mikrocisztinnel (eianotoxin) kezelt embriogén nád -kalluszokban. Anyag és módszer Kísérleteinkhez aszeptikus körülmények között előállított és fenntartott nád számnodász kallusz tenyészeteket, valamint ezekből regenerált "mini" nádnövényeket használtunk (Máthé és mtsai, 2000). A kalluszokat 28 napig szilárd táptalajon neveltük (MS táptalaj, mely 2 % szacharózt, 1 mgL"1 2,4-diklórfenoxi-ecetsavat, 0,8 % Bacto agart tartalmaz, pH 2 ,8) (Murashige és Skoog, 1962). Ezután 3 napra folyékony tápoldatba, steril Titertech lemezre helyeztük a megfelelő kalluszokat (1/2 ML táptalaj, 1 mgL"1 2,4-diklórfenoxi-ecetsav). A cianotoxin kezelést a harmadik napon végeztük, a megfelelő mennyiségű MYCLR hozzáadásával. A mikrocisztint intézetünkben nevelt Microcystis aeruginosa tenyészetekből izoláljuk és tisztítjuk Kós és mtsai (1995) által kidolgozott, majd továbbfejlesztett módszerrel. Előzetes kísérletekben megállapítottuk a MYCLR számodusz kalluszokra gyakorolt IC50 értékét mind nyers toxinkivonat, mind a tisztított toxin esetében (Máthé Cs. és mtsai, 1998). A "mini" nád növényeket ugyanabból a kalluszvonalól regeneráltuk szilárd táptalajon (MS táptalaj, mely tartalmaz 2 % szacharózt, 0,8 % Bacto agart, pH=5,8). A megfelelő méret elérése után steril kémcsövekben, folyékony táptalajban (1/2 Allen táptalaj) folytattuk a nevelést, majd végrehajtottuk a MYCLR kezelést. Fenilalanin-ammónia liáz enzim aktivitásának meghatározás A megfelelő növényi anyagból 400 mM nátrium-borát puffer (pH = 8,8), 2 mM merkaproetanol, valamint Triton-X 100 felhasználásával (Nagarathna és mtsai, 1993; Wakabayashi és mtsai, 1997) enzimkivonatot készítettünk, melyet 4°C hőmérsékleten centrifugáltunk (10000 rpm). Az enzim aktivitás meghatározásához a felülúszót használtuk. A reakcióelegy 200 mM borát puffert (pH=8,8), 60 mM L-fenilalanint, valamint enzimkivonatot tartalmazott. 37°C-on 60 percen keresztül inkubáltuk, a reakciót 10 N HCl hozzáadásával állítottuk le. Az enzimaktivitás során keletkezett t-fahéjsavat toluollal vontuk ki segítségével (Whetten és Sederoff, 1991), majd centrifugáltuk 2 percig (7000 rpm). Vak oldatnak toluolt használva spektrofotométeren (Shimadzu UV-1601), 290 nm-en lemértük a t-fahéjsav abszorbanciáját. Irodalmi adatokból ismert a t-fahéjsav extinkciós koefficiense (e . 9000 Abell és Shen, 1987), ennek alapján kiszámoltuk az 1 óra alatt keletkezett t-fahéjsav mennyiségét. A kivonat fehérjetartalmát Bradford (1976) szerint határoztuk meg. Eredmények Az irodalomi áttekintés során több módszert találtunk a PAL enzim meghatározására, amelyek azonban nem alkalmazhatók nádi kalluszok vizsgálatára. Sikerült egy megfelelő módszert kidolgoznunk a náci kalluszok PAL aktivitásának meghatározására (lásd "Anyag és módszer"). Előzetes kísérletek után meghatároztuk az enzimaktivitás fehérjefüggését (7. ábra), az inkubációs időt és a toxinkezelés időtartamától függő PAL aktivitásváltozást 20 pgmL'1 MYC-LR koncentráció esetén (2. ábra). 7. ábra PAL aktivitás függése a kivonat fehérjetartalmától A MYC-LR kezelt nádkalluszok PAL aktivitását több párhuzamos kísérletben határoztuk meg. Megállapítottuk, hogy a toxinkezelés hatására a kalluszokban fokozott PAL aktivitásra utal az emelkedett t-fahéjsav mennyisége (1. ábra). A fenilalanin-ammónia liáz enzim aktivitásának változása mikrocisztin-LR-el (eianotoxin) kezelt nád szövettenyészetekben Vigvári Tünde, Tóth Eszter, Surányi Gyula, Bácsi István, Borbély György Debreceni Egyetem, TTK, Növénytani Tanszék 2010. Debrecen, Egyetem tér 1. Kivonat: Munkánk során nád kalluszokban, vizsgáltuk a fenilalanin-ammónia liáz enzim aktivitást és megállapították, hogy a MYCLR-el kezelt nád-kalluszok, illetve "mini"-nádnövények fenilalanin-ammónia liáz (PAL) aktivitása emelkedik. A PAL enzim kulcsfontosságú a fenolos vegyületek (kávésav, ferulasav, koniferil-alkohol, stb.) bioszintézise során. Kísérleteink során a PAL-aktivitást az enzimreakció közben keletkezett t-fahéjsav mennyiségével jellemeztük. Kulcsszavak: fenilalanin-ammónia liáz, MYC-LR, Phragmites australis. Rövidítések: FHS= t-fahéjsav, PAL = fenilalanin-ammónia liáz, MYC-LR- mikrocisztin-LR 140 — 120* 1 100 180 160 g 400 200 0 100 200 300 400 protein (mikrofl/100 mikrol) 1. ábra