Magyar Nőorvosok Lapja, 1990 (53. évfolyam, 1-6. szám)
1990 / 4. szám - TERHESSÉG - Bíró Gáspár - Siklós Pál - Asztalos Miklós: Inzulin dependens diabeteses terhesek killersejt aktivitásának vizsgálata
Limfociták szeparálása (Effektor sejtek) Heparinnal alvadásgátolt 18 ml vénás vérből a mononukleáris sejteket Ficol-Uromico gradiens centrifugálással izolálták Begum módszere szerint [3 ]. A sejtek mosása után a non-adherens és adherens sejtek számát meghatároztuk. A non-adherens limfocitákat 2x106 ml1 sejtszámra állítottuk be, RPMI-1640 (Gibco) médiummal, amelyet 10%-os hővel inaktivált FCS-sel (fetal calf serum, Gibco) egészítettünk ki. Target sejtek A hemolízissel szembeni egyéni érzékenységi különbségeket elkerülendő, a target sejtekként szolgáló Rh(D) pozitív vörösvérsejteket egy donortól gyűjtöttük össze nátrium citrátban. A sejteket fagyasztottuk, majd közvetlenül a tesztben történő felhasználás előtt felolvasztottuk, és 1 %-os papainnal 10 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd mosás után 51 Cr-izotóppal 37°C-on 2 órán keresztül jelöltük a vörösvérsejteket. Az inkubációt követően a vörösvérsejteket RPMI-FCS-sel mostuk, a koncentrációt 2,4,6,8,12 X 106 ml_1-re állítottuk be. Antitest D-antigén ellen immunizált egyénektől gyűjtött szérum IgG frakcióját (250IU/100 ng IgG 1 ml-ben, a WHO standardnak megfelelően) 1:1200 véghígításban használtuk. Citotoxikus teszt A citotoxicitás enzim-kinetikai modelljét alkalmaztuk. A konstans effektor sejt (2 x 106 ml—1) maximális aktivitását 2 és 12 x 106 ml—1 között változó koncentrációjú target sejttel szemben vizsgáltuk. V-alakú mikrotálca (Greiner Labortechnik) vájataiban 50—50 mikroliter target sejtet, effektorsejtet és antitestet kevertünk össze. A vértérfogatot RPMI-FCS-sel 200 mikroliterre egészítettük ki. 37°C-on 5% C02 légterű termosztátban 16 órás inkubáció után 100 mikroliter felülúszó radioaktivitását határoztuk meg. A spontán izotóp release — a target sejtekből effektor sejtek jelenléte nélkül felszabaduló izotóp mennyisége —10% alatt volt. A maximális releaset desztillált vízben mértük; ez az összaktivitás 97—100%-ának bizonyult. A százalékos pusztulást a következő képlet szerint számoltuk: slCr release a tesztben — spontán 51Cr release x 100 maximális 51Cr release — spontán 51Cr release A citotoxicitást a milliliterenként elpusztult abszolút target sejtszámmal fejeztük ki. Statisztikai analízis Az eredményeket a kétmintás Student’s próbával értékeltük. Eredmények Diabeteses terhesek A sejt aktivitását vizsgáltuk, és hasonlítottuk össze nem terhes diabetesesek, — nem diabeteses terhesek, — valamint egészséges (nem diabeteses), nem terhes fiatal nők-sejtjeinek citotoxicitásával. A citotoxicitás enzimkinetikai modelljét alkalmaztuk, és konstans számú (2 x 106 ml1) effektor sejt citotoxikus aktivitását mértük 2 és 12 x 106 ml1 között változó koncentrációjú célsejttel szemben. Eredményeinket táblázatban foglaltuk össze. Táblázatunkban a 12 x 106 ml-1 target sejt koncentrációnál mért értékeket tüntettük fel (I. táblázat). Az általunk vizsgált 19 inzulin dependens diabeteses terhes (1. csoport) citotoxikus aktivitása alig különbözött a nem terhes diabetesesekétől (2. csoport) (p-0,242). A nem diabeteses terhesek ( 3. csoport) killersejt aktivitása szignifikánsan nagyobb volt, mint a diabeteses terheseké (p = 0,002) és ugyancsak szignifikánsan nagyobb volt a nem terhes diabetesesekénél (p = 0,005). /. táblázat Pusztult vörösvérsejtek száma (X106 ml1) 120.W ml~1 target sejt koncentrációnál Szignifikáns különbségek az egyes csoportok között: 3-1 :p ‰ 0,002,3-2: p ‰ 0,005,2-4 :p · 0,03,3-4 :p ‰ 0,0001. Az 1. és 2., valamint az 1. és 4. csoportok között nem találtunk szignifikáns különbséget. Diabeteses terheseink λ-sejtjeinek citotoxicitása nem különbözött az egészséges (nem diabeteses), nem terhes nőkétől (4. csoport), míg a nem terhes diabeteseseké szignifikánsan nagyobb volt az egészséges kontrollcsoportnál (p = 0,03). Normál terhességben a λ-sejt aktivitás kifejezett növekedését találtuk a nem terhes csoporthoz képest (p - 0,0001) Megbeszélés Jelen vizsgálataink során azt találtuk, hogy a K-sejt aktivitás terhességben szignifikánsan növekszik. Az inzulin dependens diabetesesek killersejt aktivitása is szignifikánsan nagyobbnak bizonyult a normál kontrollcsoporténál. Eredményeink megerősítik a Pozzilli és mtsai által közölt adatokat [19]. Érdekes módon azt tapasztaltuk, hogy az általunk vizsgált IDDM-es terhesek killersejtjeinek citotoxicitása nem változott a kontrollcsoporthoz viszonyítva, noha az előzőek alapján a killersejt aktivitás erőteljes növekedésére számítottunk. A nem várt jelenségre pontos magyarázatot adni nem tudunk. Fel kell tételeznünk, hogy diabeteses betegeknél terhességük során valamilyen tényező úgy változik meg, hogy hatására elmarad a normál terhességben észlelhető e-sejt aktivizálódás. Elképzelhető, hogy a változás a killersejtek működésének szabályozása szintjén következik be. A sejt közvetítette immunválaszt az újabban egyre intenzívebben tanulmányozott leukokinek, ill. számos más, nem specifikus molekula (pl. béta-2 mikroglobulin, a komplement 3-as faktora stb.) is befolyásolja. Az interleukin-2 jelentősen fokozza az NK- és K-sejtek aktivitását [1]. Ugyanígy az interferonok is aktiváló hatást fejtenek ki mind az NK-, mind a K-sejtekre [ 1, 12]. Frissen diagnosztizált IDDM-es betegekben csökkent interleukin-2 termelést mutattak ki [25], amely csökkent interferon-produkciót (és λ-sejt funkció csökkenést) eredményezhet. Fenti molekulák mennyi Csoport 1. 2. 3. 4. Diabeteses Egészséges terhes nem terhes terhes nem terhes Maximum: (n=19) (n=22) (n=69) (n=83) 6,36 5,71 8,50 5,49 Minimum: 0,66 1,34 0,07 1,22 Átlag: 2,99 3,51 4,46 2,87 S.E.M.: 0,36 0,25 0,21 0,11 ОЛ4